J Exp Med：烟酰胺单核苷酸转移酶（NNT）通过维持Fe-S肽功能而调节NSCLC线粒体代谢

人类胃癌展现出最弱大而复杂的细胞会核糖类，确实是由呼吸系统组织的高氧持续性导致的。由于活持续性氧(ROS)的降解是这种糖类的副衍生物，因此所需以烟氨基胺丝氨酸二核硫氨基(NADPH)的基本来下降血脂，以应对这种细胞会核活持续性的提升。烟氨基胺单核硫转移复合物(NNT)可通过NADPH的降解来维系细胞会核的基本功能持续性控制能力，但其在非小细胞会胃癌(NSCLC)之中的抑制作用尚未所述。本研究工作辨认出NNT的表达出来在胃癌肠道数学模型之中明显提升了的成型和波及持续性。另外，再进一步研究工作辨认出NNT不足之处就会可避免细胞会核基本功能障碍，这与血脂的大量增高无关，而是以铁硫细胞内的活持续性下降为标识。这些原因与NADPH的有效持续性和ROS的积累有关，这暗示NNT在减轻这些最重要细胞内胺基硫的分解之中起着最重要抑制作用。

实验设计

许多常见的胃癌肠道数学模型是来进行C57BL6/J肠道的家养策略而创建。像是的是，这些肠道携带纯合外显子7-11的上面不足之处以及细胞会核之中Nnt基因的错义基因型可避免非基本功能细胞内的表达出来。因此，可以来进行这种自然不足之处的基因型(NntΔex7-11)来评论NNT对胃癌时有发生的冲击。

首先，用作Kras基因型(LSL-KrasG12D/+)激起的胃癌数学模型来检测Nnt表达出来对胃癌时有发生的冲击。携带Cre重新分配复合物的腺病毒细菌感染LSL-KrasG12D/+肠道，可正向KrasG12D在呼吸系统上皮细胞之中的表达出来和呼吸系统卵巢癌的成型。来进行LSL-KrasG12D/+肠道和C57BL6/J肠道产卵导致Nnt+/+表达出来肠道或NntΔex7-11/Δex7-11表达出来肠道(左图1A-1B)。该数学模型之中Nnt的表达出来可避免Cre重新分配复合物诱发的耗损加快3个月初(左图1C-1D)。然后，来进行Kras基因型与p53不足之处同时表达出来(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也称为KP)创建胃癌数学模型。Nnt的表达出来很难改变Cre正向的KP肠道的存活率(左图1E)。像是的是，在这个数学模型之中，p53的不足之处去除了Nnt表达出来对胃癌成型的冲击，并且无论Nnt表达出来如何，实验最终都普遍存在明显的耗损(左图1F)。胃癌耗损比率的分析方法在不一定相同基因型肠道密切关系很难关联性(左图1G-1H)。

虽然不一定相同基因型肠道密切关系的耗损很难关联性，但确实检视到数学模型之中波及持续性的关联性。我们辨认出Nnt+/+肠道之中51.3%的为3级(卵巢癌)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11肠道之中有数36.5%和38.8%的是低阶(左图1I)。Nnt+/+肠道时有发生4级的振幅相当大增高，所述了波及持续性的波动(左图1J)。总之，这些信息暗示Nnt促进了胃癌的时有发生和波及。

2 NNT的不足之处不冲击细胞会核之中硫氧还细胞内(TXN)的基本功能持续性经济体制

为了再进一步评核NNT对胃癌免疫学的冲击，首先评核shRNA抑制NNT细胞内的表达出来，包括4个表达出来NNT细胞内的NSCLC细胞会系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不表达出来NNT细胞内的H441细胞会(左图2A)。抑制NNT细胞内表达出来抑制NSCLC细胞会的细胞分裂控制能力(左图2B)。并且辨认出很慢病毒细菌感染4天后NNT的下调下降了H2009和PC9细胞会的生存控制能力(左图2C)。此外，H441细胞会的细胞分裂不受NNT的冲击。

通常看来NNT有助于NADPH的还原成控制能力，从而维系细胞会核细胞内基本功能持续性系统处于还原成实际上(左图2D)。抑制NNT下降了H1299、H2009和PC9细胞会之中NADPH: NADP+的比率 (左图2E)。很慢病毒细菌感染4天后细胞会核之中H2O2相当大增高(左图2F)，所以NNT对H2O2消肿操作过程很最重要。

为了所述这些细胞会核ROS的增高是不是与细胞会核基本功能持续性系统有关，于是来进行Western blotting评核细胞会核之中过分解物细胞内3(PRDX3)的分解实际上。H2O2通过PRDX3消肿，即一对胱氨硫二硫键正向PRDX3成型单体，并且需通过TXN还原成这些胱氨硫二硫键才能还原成PRDX3的基本功能持续性基本功能。PRDX3单体的积累是PRDX3分解的标识，是细胞会核血脂的常用；也。

奥柳斯芬是一种TXN还原成复合物(TRXR)肽，虽然奥柳斯芬的外科手术就会可避免PRDX3细胞内大量分解，但NNT的不足之处并很难增高PRDX3的分解(左图2G)。此外，NNT的不足之处也很难下降细胞会核TXN2或TRXR2的细胞内准确度。总之，这些%-NNT在NSCLC细胞会细胞分裂控制能力上充分发挥最重要抑制作用，但NNT活持续性的丧失不一定就会损伤细胞会核TXN基本功能持续性系统，也不就会激起明显的血脂。

3 NNT的不足之处就会损伤细胞会核的分解控制能力

鉴于NNT在IMM之中的定位及其冲击上皮细胞上和中子温度梯度和还原成控制能力，于是试左图探讨NNT对细胞会核分解糖类是不是最重要。首先，用作海马细胞会外温度梯度分析方法仪展开细胞会核压力检验，评核NNT不足之处对一般细胞会核分解基本功能的冲击。结果辨认出NNT不足之处细胞会的耗氧量(OCR) 随细胞会核肽的依次传递而被增加(左图3A)。或多或少的是，NNT不足之处细胞会的最大新陈代谢控制能力在不依赖非耦合新陈代谢的实际上相当大下降(左图3B)。这定时细胞会核分解原因与NNT对和中子温度梯度的冲击无关。鉴于NNT不足之处明显冲击新陈代谢控制能力，于是检测NNT不足之处的H441细胞会是不是比NNT表达出来细胞会具相当多的分解和更是最弱的糖酵解控制能力。这所述这些细胞会在很难NNT的实际上确实通过细胞会核NADPH是从而维系细胞会核的基本功能。

细胞会核的分解糖类依赖ETC的基本功能，ETC由介导真核细胞的Fe-S细胞内复合物组成。考虑到Fe-S细胞内复合物的多肽操作过程所需NADPH，于是研究工作NNT抑制后细胞会核新陈代谢基本功能的下降是不是与Fe-S细胞内涉及。细胞会核压力检验可以对新陈代谢基本功能展开一般持续性的分析方法，但不可以对单个ETC复合物化学微粒展开评核。因此，原作者展开了更是为各个领域的实验来分析方法Fe-S细胞内依赖的新陈代谢涉及复合物(I, II, III)。结果辨认出，基于复合物I(硫和柠檬硫)的摄取，在NNT抑制后复合物I-III的活持续性相当大下降(左图3C)。此外，NNT原因细胞会高过了羟化酶的OCR，暗示下降了羟化酶脱氢复合物(SDH)活持续性和复合物II-III流速(左图3D)。可避免这一现象的最重要原因是SDH在ETC和TCA气化之中扮演着双重角色。

除了通过ETC维系电子流速外，Fe-S细胞内还维系对分解糖类至关最重要的其他细胞内复合物的基本功能。为了所述NNT是不是投身于其他Fe-S细胞内的基本功能，原作者评核了TCA气化之中Fe-S细胞内——顺乌头硫复合物(ACO2)的活持续性。结果辨认出抑制NNT相当大下降了NSCLC细胞会系之中ACO2的活持续性(左图3E)。ACO2活持续性的下降确实就会轻微破坏TCA气化，进而增加驱动ETC流速的还原成持续性微粒的降解。为了补充非小细胞会胃癌之中ACO2基本功能的分析方法，于是评论Nnt表达出来对KP胃癌之中ACO2活持续性的冲击。%-，Nnt+/+肠道之中Aco2活持续性明显优于NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11之中的，缺乏Nnt的展现出最高的活持续性(左图3F)。

4 外源持续性NADPH在NNT不足之处后维系Fe-S细胞内基本功能

为了所述与抑制NNT涉及的细胞会核Fe-S细胞内基本功能的下降是不是与NADPH:NADP+的下降有关，我们试左图提供一种细胞会核NADPH的外源持续性是从。为了意味着这一目的，我们不一定需要了蜂蜜细胞会核之中NADH激复合物pos5p，它可以氨基化NADH而导致NADPH。虽然pos5p以前在细菌之中也有外源表达出来，但据我们所知，pos5p还很难被转用哺乳动物系统。为了检测我们是不是需要有效地在人类NSCLC细胞会的细胞会核之中表达出来pos5p细胞内，我们对蜂蜜细胞内展开了修饰，使其包含HA-tag。Western blot%-，在H1299、H2009和PC9细胞会的细胞会核之中尝试表达出来了HA-tag标记的pos5p细胞内(左图4A)。不一定需要这些细胞会系是为了评核pos5p翻修和NNT不足之处涉及的Fe-S细胞内原因的控制能力，辨认出抑制NNT后对它们导致很轻微的冲击。

pos5p的表达出来挽回了细胞会之中抑制NNT后激起的NADPH: NADP+比率的增加(左图4B)。这与表达出来pos5p细胞会之中pos5p扰后新陈代谢肽键复杂举办活动的增加有关(左图4C和4D)。此外，pos5p的表达出来实际上挽回了NNT抑制后ACO2活持续性的下降(左图4E)。总之，这些信息暗示维系NNT表达出来不足之处时NADPH的准确度可以人身安全NSCLC细胞会之中Fe-S细胞内的基本功能。

5 NNT的不足之处不就会轻微破坏Fe-S细胞内的多肽

考虑到细胞会核外源持续性NADPH需要减弱NNT不足之处涉及Fe-S细胞内的原因，并且NADPH是高效维系Fe-S细胞内多肽的必备条件，因此我们最后试左图所述NNT活持续性是不是维系这一操作过程。Fe-S细胞内多肽时有发生在一个由胱氨硫钼复合物(NFS1)和Fe-S支架细胞内(ISCU)组成的多细胞内复合物之中。复合物之中任何一种化学微粒的不足之处都就会冲击多肽，并且也与细胞会核原因涉及。因此，我们抑制NFS1或ISCU表达出来来研究工作轻微破坏Fe-S细胞内多肽后对新陈代谢肽键和ACO2的冲击。

在H2009细胞会之中，抑制NFS1后相当大下降硫/柠檬硫反应和羟化酶反应之中新陈代谢肽键复合物I-III的活持续性，而在PC9细胞会之中只有复合物II-III活持续性被高过(左图5A和5B)。另外，两个细胞会系之中，在硫/柠檬硫和羟化酶的抑制作用下，抑制ISCU表达出来后相当大减弱了OCR(左图5A和5B)。并且抑制NFS1或ISCU后相当大下降了细胞会系之中ACO2活持续性(左图5C)。像是的是，NNT抑制后所激起的原因与Fe-S细胞内多肽所需微粒导致的原因是同等最重要的(左图5A-5C)。

为了证明Fe-S细胞内原因对NSCLC细胞会的细胞会核糖类有基本功能持续性冲击，我们对抑制NNT或ISCU细胞会展开基于液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)的糖类组学研究工作。 对这些细胞会TCA气化的糖类物展开分析方法，%-大多数之中间衍生物的丰度时有发生了相当大波动(左图5D)。这些都暗示了分解糖类的摧残和Fe-S细胞内基本功能原因的一致持续性。具体地说就是抑制NNT和ISCU表达出来后，硫、柠檬硫和富马硫被消耗。NNT不足之处细胞会之中的柠檬硫准确度被耗尽，但抑制ISCU细胞会之中并很难此结果。另外，抑制ISCU细胞会之中羟化酶大量积累，而在NNT不足之处细胞会之中则不普遍存在此现象(左图5D)。

除了Fe-S细胞内ACO2和SDH外，TCA气化还依赖另一种细胞会核Fe-S细胞内——合成酶硫还原复合物(LIAS)的基本功能。LIAS对于合成酶硫的还原以及最重要合成酶分解物基团的共轭都颇为最重要，合成酶分解物基团由PDH (E2)和α-酮乙氨基脱氢复合物(二氢合成酶氨基胺S-琥珀氨基转移复合物，DLST)组成。LIAS对Fe-S细胞内多肽的轻微破坏特别恰当，因为其Fe-S簇在甲醇操作过程之中被多余，这就要求迅速地展开细胞内交换。事实上，抑制NFS1和ISCU表达出来就会大量增加PC9细胞会之中PDH-E2和DLST的脂化，然而抑制NNT对细胞内脂化无冲击(左图5E)。总的来说，这些信息暗示，NNT引发复合物和糖类原因，它们的原因与Fe-S细胞内多肽的轻微破坏涉及，但NNT不确实直接冲击这一操作过程。这反映出抑制NNT和ISCU后对TCA气化导致类似但又不一定相同的冲击。

6 NNT的不足之处轻微破坏羧硫糖类

除了消耗TCA气化外，NNT原因细胞会的LC-HRMS糖类组学分析方法暗示羧硫糖类失调。抑制NNT促进长肽键磷脂烷基糖类的大量积累，而长肽键磷脂烷基糖类是羧硫β-分解的质子化(左图6A)。鉴于在NNT原因细胞会之中普遍存在呼吸系统脏原因，我们推测这些烷基糖类的增高是由于羧硫分解增加。我们辨认出在H1299和PC9细胞会之中OCR与珍珠分解物的分解有关，抑制NNT后OCR下降(左图6B)。我们还检视到NNT原因细胞会之中饱和羧硫和不饱和羧硫均大量积累(左图6C)。羧硫还原所需消耗大量NADPH，而且NNT抑制后NADPH的有效持续性下降，于是我们看来这些羧硫准确度的增高是由于外源持续性羧硫摄入的增高。另外，我们辨认出，NNT原因细胞会提升了对荧光珍珠硫类似物的吸收控制能力(左图6D)。为了评论NNT抑制后羧硫的积累是不是是一个潜在的不利因素，我们用作饱和羧硫珍珠硫酯刺激NNT原因细胞会24不间断，辨认出NNT抑制后使H1299和H2009细胞会对珍珠分解物恰当(左图6E)。此外，NNT抑制后相当大提高了H1299和PC9细胞会对单一不饱和羧硫油分解物的恰当持续性(左图6F)。鉴于外源持续性羧硫补充的无害冲击，我们预定细胞会外磷脂消耗将人身安全NNT的不足之处。令人震惊惊讶的是，培养基之中的磷脂消耗加剧了NNT的下调(左图6G)。更是最重要的是，NNT抑制后细胞会外磷脂缺少就会增高NADPH的消耗(左图6H)，这暗示在缺乏外源持续性羧硫的实际上致使还原羧硫，使NNT原因细胞会之中NADPH的有效持续性下降。总的来说，这些信息暗示NNT确实在调节羧硫糖类之中起最重要抑制作用，NSCLC细胞会的羧硫糖类紊乱确实是一个可来进行的弱点。

7 NNT不足之处后细胞会核抗病毒硫硫复合物(MitoCatalase)挽回Fe-S细胞内基本功能

Fe-S细胞内对分子氧和更是多二恶英的分解颇为恰当。虽然我们很难检视到细胞会核细胞内基本功能持续性系统的分解实际上时有变动，但这不一定无关NNT抑制后引发的细胞会核ROS足够将这些恰当持续性胺基硫分解。为了探究这种确实持续性，我们用作了细胞会核抗病毒的硫硫复合物(MitoCatalase)来提升细胞会核的基本功能持续性控制能力。我们尝试地在H1299、H2009和PC9细胞会之中过表达出来了MitoCatalase (左图7A)。MitoCatalase的表达出来也外减弱了NNT抑制后涉及细胞会核之中H2O2的导致(左图7B)。这与NNT抑制后新陈代谢肽键复杂举办活动的增加相对应(左图7C和7D)。另外，MitoCatalase的表达出来以后NNT抑制后ACO2的活持续性(左图7E)。综上所述，这些信息暗示，提高细胞会核消肿H2O2的控制能力可以可避免NNT抑制后Fe-S细胞内时有发生原因，从而使NNT在可避免Fe-S细胞内时有发生分解方面充分发挥抑制作用，但对Fe-S簇的多肽无抑制作用。

论据

总之，我们的研究工作暗示，NNT对胃癌免疫学具最重要意义，主要是通过调控Fe-S细胞内而促进细胞会核糖类。与以往评论NNT基本功能的研究工作不一定相同，我们阐述了NNT对NSCLC之中细胞会核分解还原成稳态的微妙冲击。在NSCLC之中，NNT活持续性确实减轻了大量分解糖类激起的血脂反应。我们的辨认出再进一步暗示了细胞会核糖类在胃癌时有发生之中的前提，所述细胞会核基本功能的提升确实是胃癌外科手术的一个最重要小分子。复合物TPH-1对大肠人身安全起最重要抑制作用，确实作为外科手术CKD的潜在外科手术小分子。

原始出处：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.